单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的

来源：学生作业帮助网编辑：作业帮时间：2024/04/30 09:18:29

单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的
单酶切问题
单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的是TAKALA的Ssp1.
顺便想问酶切后的质粒要与目的片段连接,是否需要进行胶回收纯化呢.查有篇文献构建该质粒时并没提到胶回收纯化,新手很多问题都不大懂,感谢大家关注

单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的
首先明确一个问题,你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗,也就是说你只想把这个质粒切开吗?看你的结果好象这种可能性大些,那样我觉得最有可能是梅切不完全,即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近.
建议：首先电泳时要有原质粒作对照,这样你就可以确定跑得快的带是不是未完全切开的质粒了.其次想酶切完全,可延长梅切时间,看你的体系酶的量足够了,而且酶的量本身也不应大于1/10；只是不知梅切的时间.最后若是可以确定两条带中有一条是切开的,则可以利用胶回收纯化的方法得到所需的这一载体,在和目的片段连接,注意这时凝胶回收是必要的,但若两条带太相近,则可能切的时候难分离；若是改变实验条件最终完全梅切（只一条带,且和原质粒位置有差异）,则可以用加热65度20分钟的（对于37度酶）方法将酶灭活直接用作连接载体即可,不用回收.
以上是假设你的载体这个酶切位点唯一的情况,若不是则会切下一小段片段,并且一定要凝胶回收才可得到连接载体.

单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的请问重组质粒的大小等于目的基因与质粒的和么?看了参考论文关于pUC18－bop重组质粒,提取重组质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳目的条带,与标准Marker相比较分子量约为3000bp,与预计大小一致.酶切如何区分相差400bp的两个质粒dna 最近做了连接转化,挑平板上的菌落摇菌后提质粒,单酶切可以切开,而且质粒的大小明显小于空质粒然后用质粒稀释100倍后进行PCR,可以看到目的条带,但是有拖带.然后我继续将质粒稀释至500倍, 重组质粒不进行双酶切直接跑胶,条带应该是多少?别人给的质粒,看他们的文献,双酶切之后有两条,分别是490bp（目的基因的大小）和5400bp.现在,我打算把他们寄来的质粒直接去跑1%的琼脂糖凝我有一个质粒,大小5.3k,设计的一对引物有18bp的同源区,做反向pcr来矫正这个质粒上的某个突变位点,但总问个重组质粒的电泳图和重组质粒pcr产物的电泳图的基本问题很小白,我不懂重组质粒的电泳图是如何验证重组质粒成功构建了呢,因为跑出来的大小与重组质粒应有的大小一致?还有不明白重已知人类基因组的大小约30亿bp,是计算一个二倍体细胞中DNA的总长度. 为什么胶体中的分散质粒子的大小一定大于溶液分散质粒子的大小? 单酶切和双酶切的定义分别是什么?它们有什么不同?做实验的时候要把400bp目的片断连到pcDNA3.1(+)质粒中去：单酶切质粒后用T4 DNA连接酶连接,转化到感受态细菌去,涂板有细菌生长,用目的基因关于转基因植株检测的问题我做的是大豆转基因，最近做检测，用328bp的引物做PCR时质粒很正常，可是基因组在328bp左右没有出现条带，而在700bp出现很亮的条带；用35S引物PCR，在目的条带那质粒酶切我最近在做连接,总是连不上,所以我想分析是哪步出问题.我想将酶切完的质粒载体与未酶切的质粒跑电泳看是否酶切成功,但不知道跑电泳能不能分辨出来(质粒大小10kb-12kb),如果可以琼脂糖凝胶电泳双酶切为什么没有目的基因条带我用的10000的MARKER,我的重组质粒有6000多BP,质粒5300多BP,电泳后发现只有重组质粒的条带和切下来的质粒条带,在1000BP左右并没有发现我目的基因我想麻烦问下,我想看一微升质粒有多少微克DNA,用电泳跑完了,不知道应该怎么估算,我的marker是含有1*loading buffer,标准使用量6ul,其中4000bp条带约为100ng/5ul,其余条带浓度约为50ng/ul参照片段：1000 提取的质粒跑电泳出来带很杂,目的片段1700bp,用的是pMD19—T载体,从左往右第三泳道和第九泳道是空质粒 pUC19连接了大于3kb的片段,提取质粒时质粒变小了,丢了600bp,这样我就测不到目的基因序列,怎么办? 巨大芽孢杆菌的酶切质粒应该多少BP,我用的NdeI和XhoI双酶切 . 为什么线性化质粒跑的快?对一个11kb的大载体做了单酶切,切完后线性化的质粒比未切的质粒跑的还快,为什么?线性的不是比环状的慢吗?