我最近想设计茎环结构的引物克隆MicroRNA,但不知我发给引物公司的单链引物,在我试验时是自动形成茎环结构,还是要在引物合成后进行相关的处理才会形成茎环.此引物是做miRNA逆转录用的，

来源：学生作业帮助网编辑：作业帮时间：2024/05/02 22:31:32

我最近想设计茎环结构的引物克隆MicroRNA,但不知我发给引物公司的单链引物,在我试验时是自动形成茎环结构,还是要在引物合成后进行相关的处理才会形成茎环.此引物是做miRNA逆转录用的，
我最近想设计茎环结构的引物克隆MicroRNA,但不知我发给引物公司的单链引物,在我试验时是自动形成茎环结构,还是要在引物合成后进行相关的处理才会形成茎环.
此引物是做miRNA逆转录用的，不需要变性。

我最近想设计茎环结构的引物克隆MicroRNA,但不知我发给引物公司的单链引物,在我试验时是自动形成茎环结构,还是要在引物合成后进行相关的处理才会形成茎环.此引物是做miRNA逆转录用的，
就问题本身而言,引物合成回来是固体粉末,你把它溶于水中,再做一步变性退火就行了（不过由于是hairpin,形成二聚体的可能性也很大,这个似乎不可避免）.
另外我不太明白为什么要用hairpin的引物?在pri-miRNA甚至pre-miRNA的两臂上设计引物,都可以PCR出miRNA片段.不知兄弟为何要设计hairpin引物?怎样的“克隆miRNA”,能否稍微详细的介绍一下实验思路?大家一起讨论.
看了你的原理图,大概明白了,其实就是用RT-PCR检测样品中某微量miRNA的含量,差不多吧?
我个人意见是,如果你引物序列没问题,它自己在实验时就会形成hairpin.不用预先把引物变成hairpin的理由有二.
1、实验的第一步,应是在样品中加入你的引物,准备退火.但退火之前必然有一个95度变性,然后退火.否则,样品中的miRNA可能有二级结构,不能以单链形式与你的引物互补,那就检测不到了.
既然有高温变性,那么你之前把引物退火形成hairpin就没意义了,因为在这一步同样会打开.
2、退一步讲,即使不形成hairpin,对实验的影响也不大.因为你的目的是通过引物的3'长臂端与miRNA互补,然后延伸,探针检测延伸出来的片段（绿色部分）.那么即使红色片段为线性,不是hairpin,只要序列没有问题,同样可以进行延伸的步骤,对你之后的PCR也没有太大影响（可能有错配的问题,看你引物设计的情况了）.既然整个实验红色引物是否是hairpin都没什么关系,又何必之前非要把它变成hairpin呢?
根据你的补充：
我不同意你的意见,我个人认为引物需要变性.引物中如果有茎环结构,那么必然有形成二聚体的可能,只不过根据你loop和stem的序列长短有难易区别而已.而且底物是必须要变性的,所以保险起见都是把引物加入到底物中,然后一起变性,然后退火.
实验之前预先把它变成茎环没有意义,而且也不能保证确定能形成茎环.必然会同时形成引物二聚体的形式,会影响实验效率.
欢迎讨论,祝实验顺利=)

我最近想设计茎环结构的引物克隆MicroRNA,但不知我发给引物公司的单链引物,在我试验时是自动形成茎环结构,还是要在引物合成后进行相关的处理才会形成茎环.此引物是做miRNA逆转录用的，克隆引物和表达时引物设计的区别克隆2500个碱基,该设计多长的引物呢?我准备克隆2500个碱基,引物是不是应该长一点? 最近在进行MICRO-RNA实验,在进行反转录和荧光PCR及引物设计有没有好产品?我急需进行验证实验ABIOM的试剂盒有点贵,加起来所需得18000多,公司给介绍了EXIGEN的,内参用的GPDH，是人的，在不同管里普通PCR和基因克隆PCR的引物设计有什么不同和注意事项? 基因克隆中有关点突变引物设计问题我需要用引物设计点突变一段基因的3‘端几组氨基酸密码子（每次突变一个氨基酸密码子）,突变的密码子已确定,不能用密码子的兼并性,想请问一下各位我要克隆目的基因,可在其他物种还没研究,怎么设计引物啊?你是怎么解决的啊? 简并引物经PCR的产物是不是都需要经过克隆?我设计的是一对简并引物,测序后有4个位点出现重叠峰,是不是简并引物的PCR产物都会出现此现象?克隆后就能确定这4个重叠峰的碱基吗?我现在已经我最近在做基因克隆,有三条基因,一条已经做出全长,一条有中间片段和3’端,一条只有中间片段.剩下的5‘和3’怎么都做不出来,无论是用试剂盒还是TDT法,我这个基因还很不好设计引物,得到想学习一些分子实验技术,比如设计引物、提取RNA、反转录、凝胶电泳、克隆基因核心片段、内参引物相关知识能否给我一些资料,最好是包括实验原理和实验操作步骤,还有使用到的仪器的使 microRNA茎环引物及PCR上下游引物设计和扩增原理我在文献上看到一些用茎环引物反转录microRNA时,接下来的PCR的上游引物是包含了microRNA的5‘端一部分序列,而下游通用引物则为茎环上的一部分克隆设计引物插入酶切位点的问题我要对真菌的全序列进行克隆,设计引物时是不是讲酶切位点插入到5’端就可以了?加的保护基团在酶切位点之前加就可以吗,它是随便的三个碱基吗?限制性求助保守序列查找,引物设计最近老师给了一个基因,只知道名称,让我们自己摸索,设计引物,做克隆.菜鸟一只,完全不知怎么做,希望有前辈帮帮忙,给个指导, 引物的设计 PCR扩增连接转化这一系列是什么的步骤基因克隆吗?那引物是干嘛用的如何设计随机引物我是想克隆一段已经转入水稻基因组的外源基因。打算设计一对引物其5‘端使用随机引物，中间用特异性内切酶序列，3’端使用已知目的基因两端序列。（因为完全使我的引物该如何选择?我要设计兼并引物,但是两个最佳位置处的引物Tm值相差较大,而且有二聚体和发卡结构,其余的位置兼并位点较多,不敢用来设计引物,所以现在不知道该怎么办,请师兄师姐通过设计带酶切位点的PCR引物来使目的片段添加限制性酶切位点的原理是什么?百思不得其解,我的意思是说引物人为添加上的酶切位点与要扩增的片段也不匹配,怎么能随着引物克隆到目的片引物的设计原则引物设计原则和具体步骤!原理!